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嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司,免费热线:400-698-4168。
作者:嘉美生物 发表时间:2011/1/12 阅读次数:4660(次)
关键词：嘉美生物，实验技术服务，Annexin V，重组蛋白，磷酸化抗体，各种动物ELISA试剂盒，RNA干扰，双链短RNA，RNA抽提试剂
组织材料RNA抽提防法(TRI Reagent应用)
TRI reagent应用
组织材料RNA抽提方法
MRC致力于开发各类DNA、RNA抽提试剂。该公司的专利产品TRI reagent（USA patents 4,843,155和5,346,994和世界专利）为世界最经典的产品。MRC公司除了直接销售该产品外，还为世界上多家著名分子生物学公司（如Invitrogen(GIBCO)、ABI（Ambion）、Roche、Qiagen、sigma等）提供OEM包装。
TRI reagent:
TRI reagent是美国公司Molecular Research Center(MRC)的著名品牌。该试剂是目前唯一商业化的可以从各种样本（人、动物、植物、细菌、病毒等物种的不同类型的生物样本）中同时抽提RNA、DNA和蛋白质的生物试剂，也是世界上应用最广的RNA抽提试剂。TRI reagent在室温（25℃）下有效期为2年以上。
TRIzol?是MRC公司的注册商标。
RNA抽提操作流程（组织样本抽提方法）：
TRI Reagent是目前最有效的RNA抽提方法（柱式分离RNA的方法会影响改变mRNA混合物中各mRNA分子的成分和比例），整个实验操作过程在1小时内完成。该方法抽提的总RNA中的mRNA的含量比其它方法要高30-150%。抽提的RNA可用于Northern杂交、点杂交、mRNA分离、体外翻译、RNase保护分析、分子克隆和RT-PCR等实验。
主要步骤：
组织或细胞匀浆
如果材料是组织，使用的组织和TRI Reagent试剂的比例控制在50-100 mg tissue/ml TRI reagent，组织的体积最好不要超过TRI体积的10％。如果材料是单层培养细胞，需要将TRI Reagent试剂直接加入培养平板（培养基去除后立即加入）中，枪头吸打细胞裂解液多次（10 cm2平板面积/ml TRI Reagent）。如果是悬浮培养的细胞，先沉淀细胞，然后加入TRI reagent（5 - 10 x 106 动植物或酵母细胞/ml TRI Reagnt；107 细菌细胞/ml TRI Reagent），反复吸打混匀。
注：对于一些特殊组织（如蛋白、脂肪、多糖成分含量较多的样本、肌肉组织、脂肪组织和植物的块茎组织），需要特殊的处理才能获得质量较高的RNA。匀浆后，4℃ 12,000 g离心10分钟除去不溶物质，沉淀中包括有多糖、细胞间质成分和高分子量DNA等，目的RNA存在上清中。
加入TRI Reagnt前不要洗涤细胞，否则容易造成mRNA降解。对一些酵母和细菌细胞，可能需匀浆处理。此时细胞匀浆液可以保存在-70℃至少一个月。
室温静置5-10分钟（细胞裂解过程），促进核酸与蛋白的解聚。
加0.1mlBCP（0.2ml氯仿/ml TRI），剧烈震荡15秒钟。
室温静置2-15分钟（氯仿使蛋白变性）。
4℃ 12000g，15分钟。此时溶液分为三层，最下一层是红色的有机溶液相（苯酚、氯仿和DNA），中间层（变性蛋白为主要成分）和无色的上清液（RNA溶液）。
取上清（上清的体积一般为匀浆加入TRI Reagent的体积的60％）转移入新离心管中（确保不能有中间层蛋白的污染），加异丙醇(0.5ml/ml TRI reagent)，混匀室温静置5-10分钟。
4℃ 12000g，离心8分钟。RNA在管壁形成胶状或白色沉淀。
去上清，加入75％乙醇洗沉淀（一般建议加入75％乙醇的体积与匀浆用TRI Reagent的体积相等），然后4℃ 7500-12000 g，离心5分钟。 溶解在75%乙醇中的RNA可以在4℃保存一周以上，-20℃可以保存至少一年。
风干，3-5分钟。注意不要让RNA沉淀过于干燥，否则影响RNA的溶解。不要真空干燥。
DEPC处理水溶解，-80℃保存。
RNA质量检测：
OD260/OD280 比值在1.6-1.9。当比值>2.2时，说明RNA已完全降解。
总RNA通过变性凝聚电泳检测质量，图谱如下：
两条rRNA主带，大小分别是~2 kb和~5 kb，当5kb带的亮度大约是2kb带亮度的2倍时，RNA质量最好。
小分子RNA带，大约0.1-0.3 kb
mRNA的smear（带的大小不连续）
一、RNA抽提注意事项
尽可能无RNA酶的环境下操作，最好有专门的实验场所
耗材的处理：
电泳槽需0.5 M NaOH处理过夜后DEPC水清洗
试管氯仿浸泡处理过夜后DEPC水清洗
枪头和离心管用DEPC水浸泡后灭菌处理
实验者本身防护：带一次性手套，要勤换手套。
启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成。
正确的操作方式，不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。
二、RNA操作常见问题分析
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 产量太低 | 样本裂解或匀浆不充分 | 延长匀浆时间 |
| RNA沉淀溶解不充分 | 可65℃加热10分钟促进RNA溶解 | |
| A260/A280 | 匀浆时，样本太多，而TRI reagent使用量太小 | 按照正确的样品与TRI reagent比例 |
| <1.65 | 匀浆后，样本没有放置室温静置5分钟 | 匀浆后放置有利于RNA与蛋白的解离 |
| 水相中可能有酚残留 | 吸取上清动作要轻，不要搅动有机相 | |
| 蛋白沉淀污染 | 吸取上清动作要轻，不要搅动蛋白沉淀层 | |
| RNA沉淀溶解不充分 | 可65℃加热10分钟促进RNA溶解 | |
| 测比值时，RNA溶液稀释在DEPC水而非TE溶液中，低离子浓度和PH值增加了280nm吸光值 | 使用TE溶液稀释RNA溶液 | |
| RNA降解 | 取样不正确， 样品取下后没有立即抽提或冻存 | 取样后应立即抽提和冻存 |
| 样本保存不当 | 液氮或-80℃冻存，避免反复冻融 | |
| 液相中可能有RNA酶污染 | 可适当加入RNA酶抑制剂 | |
| 制胶时所用甲醛的PH值过低 | 注意甲醛的PH值不要小于3.5 | |
| DNA污染 | 匀浆时，样本太多，而TRI reagent使用量太小 | 按照正确的样品与TRI reagent比例 |
| 样本中含有机溶剂（如乙醇、DMSO等）、高离子浓度或呈碱性 | ||
| 液相分离所用温度高于10℃ | 4℃离心处理，液相分离 | |
| 蛋白多糖污染 | 样本中蛋白、脂肪、多糖成分含量较多 | RNA沉淀时，加入异丙醇（0.25ml异丙醇/ml TRI reagent）和高盐沉淀溶液（0.25ml高盐溶液/ml TRI reagent，MRC公司提供，Cat# PS 161），混合溶液，室温静置5-10分钟，4-25℃ 12,000 g离心8分钟。此时RNA沉淀，而蛋白多糖仍然保留在液相中。 |
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